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導讀

南京大學郭子建院士、何偉江教授團隊和上海師范大學楊仕平教授課題組利用酮-烯醇過渡傳感機制，研制了第一個光學/PA雙模探HS-CyBz，用該探針在小鼠體內實現了半胱氨酸酶激活物S-腺苷-蛋氨酸(SAM)刺激內源性H2S上調的比率型成像。相關成果發表在J. Am. Chem. Soc.上。（DOI: 10.1021/jacs.9b09181）

H2S作為第三種氣體信號分子，參與體內血管擴張、血管生成、抗氧化、抗炎和中樞神經系統的調節。因此，實時追蹤H2S在活體中的濃度波動，對研究H2S濃度變化致病的病理機制具有重要的意義。目前已有多種熒光探針被開發應用于細胞內H2S成像，然而，這些探針只能顯示H2S的分布而不能實時追蹤組織深層H2S的波動。PA成像(photoacoustic 成像，光聲成像)能顯示組織深部幾厘米的成像，但其靈敏度和分辨率較低。

南京大學郭子建院士、何偉江教授團隊和上海師范大學楊仕平教授課題組結合了光學成像和PA成像的互補優勢，利用酮-烯醇過渡傳感機制，研制了光學/PA雙模探針meso-hydroxyltricarboheptamethine cyanine HS-CyBz和HS-CyBz-1（Figure 1），HS-CyBz比HS-CyBz-1有更高的靈敏度和更快的響應速度（Figure 2）。

Figure 1.HS-CyBz的H2S-響應機理和HS-CyBz-1的化學結構（圖片來源：J.Am.Chem.Soc.）

Figure 2.HS-CyBz和HS-CyBz-1響應速度對比（圖片來源：J.Am.Chem.Soc.）

HS-CyBz的吸收光譜在775 nm處呈銳吸收帶，708 nm處為肩帶。探針在pH 7.4下與Na2S反應，導致銳帶明顯減小，在850 nm處略有增加，在825 nm處出現等滲點(Figure 3)。表明該探針可能是一個HS-響應的比率型探針。

Figure 3.HS-CyBz的紫外和熒光光譜（圖片來源：J.Am.Chem.Soc.）

作者研究了HS- CyBz對其他的生化活性物質的響應，發現只有Na2S能顯著提高F630/ F805和PA825/PA775（Figure 4aand 4b）。HS-CyBz溶液做PA成像，當以825 nm（等滲點）激發，隨著HS-滴定PA信號的變化較弱且穩定，而在775 nm處激發，PA信號明顯降低。PA825/PA775的比值幾乎線性增加，HS-從0mM到1 mM滴加，PA825/PA775從0.2增加到0.7（Figure4c）。PA825/PA775的線性變化顯示了比率光聲對H2S的響應能力。

Figure 4.a.HS- CyBz對其他的生物活性物質的光學響應b.HS-CyBz溶液對其他的生物活性物質PA成像c.HS-CyBz溶液以825 nm和775 nm激發的PA成像（圖片來源：J.Am.Chem.Soc.）

在沒有光學成像和PA成像相結合的商業設備的情況下，作者在小鼠身上分別研究了HS-CyBz對H2S的比率光學成像能力和比率PA成像能力。6周大的小鼠后肢皮下注射檢測其體內比率光學成像，通道1（620±20 nm）成像表明，小鼠后肢A和B處的熒光弱幾乎是被組織自體熒光掩蓋（Figure 5a）。隨后在B處注入Na2S導致熒光增強約1.60倍，但仍被組織自體熒光所掩蓋。對照組A處經生理鹽水注射后，增強系數較小，約為1.21倍（Figure 5b）。通道2（790±20 nm）成像無明顯的自體熒光干擾（Figure 5c），Na2S注入導致熒光減弱約0.63倍，對照組A減弱約為0.94倍（Figure 5d）。因此，在B處注入Na2S使比率熒光F620/F790增加約2.54倍，表明HS-濃度增加。對照組A顯示微弱的比率熒光增強約1.28倍（Figure 5e）。在B處Na2S導致的比率熒光F620/F790增強比單通道F620熒光增強更加明顯。這些數據表明體內比率光學成像比單通道熒光成像更加準確靈敏，有效地降低了自體熒光的干擾和探針濃度偏差的影響。

小鼠背部皮下C和D處進行雙通道光聲成像，兩個通道分別檢測探針的光聲信號（Figure 5f and 5h）。在D處注射Na2S使兩個通道信號均減弱（Figure 5g and 5i），與預期通道3信號減弱而通道4信號不變不同，猜測是注射擴散導致探針濃度下降引起的。而D處的信號比率PA825/PA775隨著Na2S的注入增加至0.6，對照組C的PA825/PA775約為0.53,證實D處HS-濃度增強。以上數據表明比率型PA成像比單通道PA成像更能減少濃度偏差造成的影響。

Figure 5.a-e.體內比率光學成像（Ch 1：620±20 nm，Ch 2：790±20 nm，λex=560 nm）f?j.比率PA成像（Ch 3：775 nm，Ch 4：825 nm）（圖片來源：J.Am.Chem.Soc.）

作者給小鼠注射HS-CyBz和半胱氨酸酶激活物S-腺苷-蛋氨酸(SAM)驗證SAM刺激內源性H2S上調。通道2（790±20 nm）光學成像顯示注射SAM的小鼠熒光比空白組低很多（Figure 6a），表明SAM能顯著提高HS-的水平。離體臟器體外成像顯示該探針在肝臟中聚集（Figure 6a）。注射SAM的小鼠比未注射小鼠離體肝臟的比率熒光F620/F790明顯較高（Figure 6b），證實SAM注射誘導內源性H2S上調。如圖所示（Figure 6c and 6d），單通道PA成像很難判斷是否為SAM注射引起的上調，而PA比率PA825/PA775從0.59提高到了0.65（Figure 6e），證實SAM引起內源性H2S上調，顯示了雙通道比率PA成像的優越性。

Figure 6.a-b.注射SAM的小鼠光學成像c-e.注射SAM的小鼠PA成像（圖片來源：J.Am.Chem.Soc.）

總結：南京大學郭子建院士、何偉江教授團隊和上海師范大學楊仕平教授課題組利用酮-烯醇過渡傳感機制，研制了第一個光學/PA雙模探針meso-hydroxyltricarboheptamethine cyanine（HS-CyBz），實現了對小鼠皮下注射H2S的光/光聲雙模成像，兩種模式的比率成像有利于減輕組織自身熒光的干擾和探針濃度偏離的影響。尾靜脈注射探針和SAM導致小鼠肝臟內H2S積聚，經光學/PA雙模成像證實，SAM刺激小鼠肝臟內源性H2S增強。本研究表明比率光學/PA雙模成像是一種有效的跟蹤信號小分子（SSM）在活體小鼠和組織中上調的方法，光學成像和PA成像相結合的透視技術將會促進SSM生物學的發展。

撰稿人：桐豆